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產(chǎn)品說明：

使用說明：

產(chǎn)品描述：

嘌呤霉素是由Streptomyces alboniger生產(chǎn)的氨基核苷類抗生素。它能特異性地抑制原核和真核糖體上的肽鏈轉(zhuǎn)移。這種抗生素抑制革蘭陽性細(xì)菌和各種動物和昆蟲細(xì)胞的生長。嘌呤霉素在某些特定條件下也可用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選。嘌呤霉素的抗性是由puromycin N-acetyl-transferase的pac基因賦予的。動物細(xì)胞一般對1~10ug/ml濃度敏感。

1. 建議使用濃度

哺乳動物細(xì)胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線來確定。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。

2. 溶解方法

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/mL的儲存液。

3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線（kill curve）。

1）Day 1：24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續(xù)的梯度實驗。37℃細(xì)胞孵育過夜。
    2）Day 2：①準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15 μg/mL，至少5個梯度）；         ②往孵育過夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細(xì)胞。

3）Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞存活率。

4）根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。
5）每日監(jiān)測細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物最低濃度。

4. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞（原樣或稀釋）置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

【注】：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進行細(xì)胞分盤使其密度不超過25%。

2）每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3）篩選7天后評估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。

【注】：每日進行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
    4）轉(zhuǎn)移和放置5-10個抗性克隆到一個35 mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實驗做準(zhǔn)備。

注意事項：

1）嘌呤霉素為有毒化合物，操作時請小心拿放。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。