PEI 40K Transfection Reagent 線性化聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染試劑

特性說(shuō)明：

產(chǎn)品描述：

線性化聚乙烯亞胺PEI 40000 (Polyethylenimine Linear, MW 40000; PEI 40K)是一款優(yōu)秀和低成本的瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染試劑。 在HEK293和CHO表達(dá)系統(tǒng)中，PEI在寬廣的生產(chǎn)規(guī)模內(nèi)(從96孔板到100L生物反應(yīng)器) 能提供連續(xù)性的高基因表達(dá)。

作為線性化聚Z烯亞胺PEI25000 (PEI 25K)的升級(jí)產(chǎn)品，操作更簡(jiǎn)單，且具有連續(xù)性的更高表達(dá)滴度，優(yōu)勢(shì)在于: 1) PEI 25K轉(zhuǎn)染溶液通常需幾個(gè)小時(shí)來(lái)配置，然而，PEI 40K在2個(gè)小時(shí)內(nèi)即可轉(zhuǎn)化為即用型的溶液; 2) PEI 25K含4-11%殘留的丙酰基基團(tuán)，該基團(tuán)阻止聚合物骨架緊密結(jié)合到DNA。然而，PEI 40K完全去丙酰化結(jié)構(gòu)，意味著每個(gè)批次保持連續(xù)性更高轉(zhuǎn)化效率。

本品是PEI 40K的無(wú)菌溶液，濃度為1mg/ml,直接使用即可。1ml本品足以用來(lái)轉(zhuǎn)染250μg DNA,或者，6孔板內(nèi)約做60- 120次轉(zhuǎn)染。

試劑準(zhǔn)備:

稀釋液準(zhǔn)備:用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)水來(lái)制備150mM NaCl (比如: 稱取876.6mg高純NaCI加入80ml細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)水，充分溶解后，定容到100ml,經(jīng)0.1或0.2μm濾膜過(guò)濾除菌。)

[注意] :也可使用商業(yè)化的無(wú)血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM |)來(lái)制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

一、貼壁細(xì)胞操作方法

1.1鋪板

a) 轉(zhuǎn)染前18-24h進(jìn)行鋪板，調(diào)整合適的細(xì)胞密度(參考表1)，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)60-80%.[注意] :高血清水平會(huì)抑制轉(zhuǎn)染效率，大多數(shù)情況，低血清水平(≤5%) 能產(chǎn)生最高的轉(zhuǎn)染效率。

1.2轉(zhuǎn)染步驟(以6孔板的單孔為例)

a)轉(zhuǎn)染前1-2h, 每孔替換為3m|含2%血清的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

b)制備PEI 40K-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物(嚴(yán)格按照順序進(jìn)行) :①往300μI稀釋液內(nèi)加入2μg質(zhì)粒DNA,低速混合/渦旋均勻;②往混合物內(nèi)加入8μIPEI 40K (1mg/ml) (DNA/PEI 40K=1: 4)， 低速渦旋5s;③無(wú)菌環(huán)境，室溫靜置20min以形成PEI 40K-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物。④用移液槍上下吹打3次，輕輕混勻。

c)將PEI 40K-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)到孔內(nèi)。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿或輕微渦旋，使得復(fù)合物分散均勻。

[注意] :以上步驟可通過(guò)調(diào)整PEI 40K-DNA復(fù)合物在稀釋液內(nèi)的體積(稀釋液為培養(yǎng)總體積的10%)來(lái)進(jìn)行放大或縮小(可參考表2)。確保DNA/PEI 40K=1: 4!

1.3孵育
a) 37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12-18h,去除含PEI 40K-DNA復(fù)臺(tái)物的培養(yǎng)液，更換新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

b) 通常，轉(zhuǎn)染后36-48h能檢測(cè)到重組蛋白表達(dá)。一般在轉(zhuǎn)染后72-96h能觀察到最大水平的表達(dá)。

二、懸浮細(xì)胞操作方法

2.1接種準(zhǔn)備

于轉(zhuǎn)染前2-3h,按照1 .0x 106/ml培養(yǎng)接種細(xì)胞。

2.2轉(zhuǎn)染步驟(以: 50ml培養(yǎng)物/250ml搖瓶為例)

a)制備PEI 40K-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物(嚴(yán)格按照順序進(jìn)行) :①往2.5ml稀釋液內(nèi)加入50μg質(zhì)粒DNA,低速混合/渦旋均勻;②往混合物內(nèi)加入200μl PEI 40K (1mg/ml) (DNA/PEI 40K=1: 4)，低速渦旋5s;③無(wú)菌環(huán)境，室溫靜置20min以形成PEI 40K-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物。④用移液槍上下吹打3次，輕輕混勻。

b)將全部轉(zhuǎn)染溶液加入25ml懸浮細(xì)胞內(nèi)。

c)將懸浮細(xì)胞放回培養(yǎng)箱內(nèi)。

2.3孵育

a)在培養(yǎng)箱內(nèi)搖動(dòng)培養(yǎng)2-3h,之后加入25ml新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。重新放回培養(yǎng)箱。

b)通常,轉(zhuǎn)染后36-48h能檢測(cè)到重組蛋白表達(dá)。一般在轉(zhuǎn)染后72-96h能觀察到最大水平的表達(dá)。

注意事項(xiàng)：

1) 請(qǐng)務(wù)必使用高質(zhì)量的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過(guò)260 nm光吸收測(cè)定DNA濃度, 260nm/280nm比值確定DNA純度(比值應(yīng)該在1.8 ~ 2.0的范圍之內(nèi))。如有可能，請(qǐng)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒的完整性。

2)使用適當(dāng)保存和經(jīng)常傳代的健康細(xì)胞。確保培養(yǎng)基沒有被細(xì)菌、真菌或支原體污染。如果細(xì)胞是近期復(fù)蘇的液氮凍存細(xì)胞，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染前至少傳代兩次。

3)對(duì)于某些類型的細(xì)胞如HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS細(xì)胞， 在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高重組蛋白的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為60-80%。

4)對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。

5)為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。