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特性說明：

產(chǎn)品描述：

花菁類染料（Cyanine Dyes）是一種在兩個(gè)氮原子間含聚亞甲基橋鍵且攜帶一非定域電荷的分子。

歸其結(jié)構(gòu)特征，花菁素具有極其高的消光系數(shù)通常高于 100,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 。不同的替代基允許控制發(fā)光團(tuán)的性能比如吸光波長，光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度。例如，通過選擇不同長度的聚亞甲基橋鍵能夠控制吸光和熒光波長：花菁素越長，吸光和發(fā)射波長更高，高達(dá)至近紅外區(qū)。

在生命科學(xué)領(lǐng)域廣受歡迎的花菁類染料由美國卡耐基梅隆大學(xué)（CMU）的 Alan Waggoner 教授和同事于二十世紀(jì) 90 年代早期研發(fā)應(yīng)用。這些染料呈現(xiàn)出低的生物分子非特異性結(jié)合，并由其巨大的消光系數(shù)和良好的量子產(chǎn)量產(chǎn)生明亮的熒光。目前商業(yè)化可提供各種反應(yīng)性衍生物，比如點(diǎn)擊化學(xué)用的 N-羥基琥珀酰亞胺酯，馬來酰亞胺，疊氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以兩種異構(gòu)體的形式供應(yīng)：一種非磺化的花菁類染料和磺化的花菁類染料，對(duì)于許多應(yīng)用，兩種是可以互相替換的，因其光譜屬性基本相同。兩種染料都可用于 DNA 和蛋白質(zhì)等生物分子的標(biāo)記。兩者的區(qū)別在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水環(huán)境中標(biāo)記，無需有機(jī)共溶劑，且在水中不易聚集。

Sulfo-Cyanine3 NHS Ester (Sulfo-Cyanine3 SE)是 Cyanine3 的水溶性、胺反應(yīng)活化酯，能夠在純水溶性環(huán)境或無任何有機(jī)溶劑反應(yīng)體內(nèi)進(jìn)行蛋白和多肽的有效標(biāo)記。非常適合具極低水溶性和易變性蛋白的標(biāo)記。

使用方法

【注意】：Cy 染料和生物分子的比例（F/P）=4~12 之間熒光強(qiáng)度最高。F/P 過高，熒光探針會(huì)自我淬滅并且影響生物分子的活性。CyDye NHS 在 pH 8.5~9.4 內(nèi)標(biāo)記抗體 10min，F(xiàn)/P 可達(dá) 5~6。但在 pH 7.0 內(nèi)幾乎無反應(yīng)。我司內(nèi)部使用 Cy3 NHS 標(biāo)記 Anti-GST 抗體發(fā)現(xiàn)按 1:1，1:5，1:10，和 1:20 標(biāo)記得到的 F/P 分別為 0.28:1，1.16:1，2.3:1 和 4.6:1。

一、 水溶性 Cy3 NHS 標(biāo)記 Anti-GST 抗體【其它 CyDye NHS 參考此方法進(jìn)行并做適當(dāng)摸索】

商業(yè)化購買的抗體如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明膠等），或溶于帶氨基的緩沖液，會(huì)影響標(biāo)記。需在標(biāo)記前對(duì)抗體進(jìn)行純化。

1. 于 1L 0.15M NaCl 溶液中透析 Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室溫或 4℃透析 4h。

2. 換用 1L 新鮮的 0.15M NaCl 溶液，4℃透析過夜。

3. 第二天再換用 1L 0.1M NaHCO ₃ （pH 8.3），4℃透析 4h。

4. 【可選】用 0.22μm 低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

5. 用 0.1M NaHCO ₃ （pH 8.3）稀釋少量的抗體，于 280nm 測(cè)其紫外吸收值并計(jì)算標(biāo)記抗體的總量（IgG抗體摩爾吸光系數(shù)為 170,000 at 280nm）。

6. 用 DMSO 配制 Cy3 NHS（Mw:765.95），濃度為 10mg/ml。根據(jù) CyDye NHS 和抗體的使用比值（比如1:20）來計(jì)算所需要染料的體積。然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)于暗處低速攪拌，室溫 45min。

7. 用 1L 0.15M NaCl 溶液，常溫或 4℃避光透析 4h，以除去未標(biāo)記上的 Cy3 NHS。

8. 換用新鮮的 1L 0.15M NaCl 溶液，4℃避光透析過夜。

9. 換用 1L 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液室溫或 4℃避光透析 4h，然后在 4℃避光再次透析過夜。

10. 【可選】用 0.22μm 低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

11. 用 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體，測(cè)定 280nm（蛋白）和 552nm（Cy3）處的紫外可見吸光度。

12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或置于 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液中，-20℃避光保存。

【F/P 計(jì)算】：

Cy3 在 552nm 下的摩爾吸光系數(shù)為 150,000 L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，此蛋白在 280nm 的摩爾吸光系數(shù)為 170,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不同。Cy3 本身在 280nm 處的吸收是 552nm 處的 8%。按照以下公式計(jì)算 F/P 值。

[Cy3] = A ₅₅₂ /150000; [Antibody] = [A ₂₈₀ -(0.08×A ₅₅₂ )]/170000

F/P final = [Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A ₅₅₂ ]/ [A ₂₈₀ -(0.08×A ₅₅₂ )]

二、 水溶性 Cy5 NHS 記 標(biāo)記 （D-ser ² ） ）- Leu-Enkephalin 【其它 CyDye NHS 參考此方法進(jìn)行并做適當(dāng)摸索】

1. 低溫保存的 Cy5 NHS 置于室溫回溫至少 20min。往 1mg 粉末內(nèi)加入 400μl 高品質(zhì)無水 DMSO 充分溶解。同樣，低溫保存的玻璃瓶裝的（D-ser ² ）- Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室溫回溫后加入 400μl高品質(zhì)無水 DMSO 充分溶解。將 400μl Cy5 NHS 加入 400μl 多肽內(nèi)。【染料與多肽通常質(zhì)量比 1:1】。

2. 再加入 15μl 三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物，過夜。【若多肽穩(wěn)定性較弱，則于 4℃反應(yīng)過夜】。

3. 用 HPLC 純度多肽。使用 C18 柱子（25cm×10mm），每次上樣注入 2×400μl，30min 梯度洗脫從 0.1%TFA 水溶液到 MeCN:H ₂ O (0.1% TFA)=70：30，流速 4ml/min。（對(duì)不同的多肽選擇不同的合適 HPLC梯度流動(dòng)相）

4. 收集適當(dāng)?shù)纳珟Х澹瑯?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長。

5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

6. CyDye 標(biāo)記的蛋白/多肽穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的 IgG 在 4℃可避光保存 2 月，更長保存需加入等體積甘油-20℃避光保存。

【F/P 計(jì)算】：

Cy5 在 650nm 下的摩爾吸光系數(shù)為 250,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，此蛋白在 280nm 的摩爾吸光系數(shù)為 170,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不同。Cy5本身在 280nm 處的吸收是 650nm 處的 5%。按照以下公式計(jì)算 F/P 值。

[Cy5] = A ₆₅₀ /250000; [Peptide] = [A ₂₈₀ -(0.05×A ₆₅₀ )]/170000

F/P final = [Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A ₆₅₀ ]/ [A ₂₈₀ -(0.05×A ₆₅₀ )]

注意事項(xiàng)：

1）Sulfo-Cyanine3 NHS Ester 水溶液的穩(wěn)定性很弱，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。Sulfo-Cyanine3 NHS Ester DMSO 溶液的穩(wěn)定性相對(duì)高，建議置于-20℃避光保存，2 周穩(wěn)定。

2） Sulfo-Cyanine3 NHS Ester 具水溶性，除非標(biāo)記實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格要求純水溶性環(huán)境，建議用 DMSO 溶解配制成母液后使用。一般情況下，Cy 系列染料在含有機(jī)溶劑體系內(nèi)的標(biāo)記效率相對(duì)高些。

3） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。