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產(chǎn)品說明：

產(chǎn)品描述:

Calcein-AM是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein, AM細(xì)胞毒性極低，是最適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅用于對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。作為核染色染料的碘化丙啶不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(激發(fā)：535 nm，發(fā)射：617 nm)，因此PI僅對(duì)死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。根據(jù)以上特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，我們建議個(gè)別確定 Calcein, AM 和 PI的合適濃度。

本品為粉末形式提供的Calcein-AM，超純級(jí)別（≥95%），可與碘化丙啶（PI）聯(lián)合使用，用于活細(xì)胞和死細(xì)胞的同時(shí)檢測。或者直接購買翊圣提供的Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒。

使用方法：

1. 儲(chǔ)存液的配制

本品是以粉末形式提供的，根據(jù)工作液的濃度將其配制成1000×的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存液配制范圍可為1～50 mM。例如使用的工作液為5 μM，那么可配制5 mM的儲(chǔ)存液，也就是向50 μg Calcein, AM（Mw：994.86）內(nèi)加入10 μl 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的DMSO即可得到所需濃度的儲(chǔ)存液。

2. 染色步驟

對(duì)于大部分細(xì)胞，鈣黃綠素Calcein, AM的工作液濃度為2-5 μM。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果。
1）使用時(shí)，取一管適量的Calcein, AM儲(chǔ)存液（1000×），用PBS（或Hanks和Hepes）緩沖液將其稀釋成相應(yīng)濃度的染色工作液。
        注：有時(shí)候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲(chǔ)存液內(nèi)來增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM儲(chǔ)存液內(nèi)加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長期保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2）對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3 min）。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接離心收集細(xì)胞。
3）去上清，用PBS（或者其他緩沖液）充分清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4）用1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細(xì)胞，37℃培養(yǎng)細(xì)胞15～30分鐘。
        注：如果細(xì)胞本身含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，需加入丙磺舒（probenecid，1-2.5 mM）或者苯磺唑酮（sulfinpyrazone，0.1-0.25 mM）到孵育體系內(nèi)以降低去酯化染料calcein泄露到胞外。
5）用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細(xì)胞兩次去除多余的染料。
注：如有必要，使用含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩沖液來進(jìn)行細(xì)胞清洗】

6）用含490 nm激發(fā)波長，515 nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：

1）對(duì)于微量試劑，開封前，請(qǐng)稍微離心一下，以保證粉末落入管底。
2）由于Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，本粉末保存的過程中一定要保持干燥。對(duì)于配制好的Calcein-AM儲(chǔ)存液需要分裝凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

3）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。