產(chǎn)品描述：

Percoll是一種適用性廣且操作靈活簡單的低密度梯度分離液，可用來分離細(xì)胞，亞細(xì)胞顆粒，細(xì)菌，病毒，甚至實(shí)現(xiàn)受損細(xì)胞及其碎片與完整活細(xì)胞的分離。

Percoll主要由表面包被單層乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）的硅膠顆粒組成，直徑15-30 nm，游離PVP的含量僅占1-2%。PVP涂層使得Percoll完全無毒且為生物材料分離的理想產(chǎn)品，PVP以單分子層緊緊粘附在硅膠顆粒表面。由于顆粒大小的異質(zhì)化，離心過程以不同的速率沉淀，自發(fā)產(chǎn)生一個勻質(zhì)化且等滲的梯度，密度在1.0-1.3 g/ml之間。大部分沉淀系數(shù)＞60S的生物顆粒都可以用Percoll實(shí)現(xiàn)分離。

產(chǎn)品特征：

1）Percoll形成的梯度密度范圍在1.0-1.3 g/ml之間，整個梯度體系都是等滲的；

2）無細(xì)胞毒性，化學(xué)惰性，不會粘附到細(xì)胞膜上；

3）可調(diào)節(jié)至生理離子強(qiáng)度和pH；

4）溫和條件分離細(xì)胞，亞細(xì)胞顆粒和較大病毒（低至~70S），可保持其活力和形態(tài)完整性；

4）只需角轉(zhuǎn)頭中速離心即可實(shí)現(xiàn)預(yù)成梯度或者自發(fā)形成梯度分離；

5）Percoll粘度低（10±5 cP at 20°C），能夠快速形成梯度和顆粒分離；采用預(yù)制梯度分離低速離心力（200-1000 × g）僅需數(shù)分至數(shù)十分鐘即可達(dá)到滿意的分離結(jié)果；

6）Percoll穩(wěn)定性高，未開封的產(chǎn)品室溫保存5年有效；開封的產(chǎn)品室溫?zé)o菌保存至少2年有效；

7）Percoll（未稀釋）可重新高壓滅菌，120°C，30min；

產(chǎn)品參數(shù)：

使用方法

1.不同密度Percoll溶液的制備

【注意】：Percoll最好稀釋于緩沖液，生理鹽水或0.25 M 蔗糖溶液中。細(xì)胞樣本可用緩沖液如PBS來進(jìn)行梯度分離；而亞細(xì)胞顆粒，可能會在鹽離子存在的情況下聚集在一起，建議使用蔗糖溶液（終濃度0.25 M）來進(jìn)行梯度分離。

1.1 等滲Percoll溶液（SIP）的制備

取9份Percoll（v/v）加入1份1.5 M NaCl，10×濃縮培養(yǎng)基，1.5 M PBS或2.5 M 蔗糖溶液混勻即可。可通過加入鹽離子或者蒸餾水來調(diào)整滲透壓到最后需要的值。細(xì)胞密度取決于滲透壓，因此，SIP溶液的滲透壓常規(guī)來說需要用滲壓計(jì)來調(diào)整以確保實(shí)驗(yàn)間結(jié)果的可重復(fù)性。通過以下公式來計(jì)算SIP溶液的密度，

此公式中，Vx= volume of diluting medium (ml)；V0= volume of undiluted Percoll (ml)

ρ0= density of Percoll (1.130+0.005g/ml)；

ρ10= density of 1.5M NaCl=1.058g/ml(minor differences for other salts)；

density of 2.5M sucrose=1.316g/ml(minor differences for other additives)

ρi= density of SIP solution produced(g/ml)

Thus, for SIP in saline, ρi=1.123g/ml and for SIP in sucrose, ρi=1.149g/ml, assuming ρ0=1.130g/ml.

1.2 稀釋SIP溶液到需要密度

直接使用0.15 M NaCl或1×細(xì)胞培養(yǎng)液（正常滲透壓）稀釋SIP到需要的密度，用于細(xì)胞分離；直接使用0.25 M 蔗糖溶液稀釋SIP用于亞細(xì)胞或者病毒分離。通過以下公式來計(jì)算調(diào)整SIP到需要的密度，

此公式中，Vy= volume of diluting medium in ml; Vi= volume of SIP in ml;

ρi= density of SIP in g/ml; ρ = density of diluted solution produced in g/ml;

ρy= density of diluting medium in g/ml

(density of 0.15M NaCl is～1.0046g/ml)

(density of 0.25M sucrose is～1.032g/ml)

注意：以上公式調(diào)整得到的實(shí)際密度僅僅與預(yù)定密度非常接近，并不能保證完全相同。因?yàn)榧尤塍w積和稀釋液密度的微小變化都會影響最終結(jié)果。要想知道實(shí)際密度，建議使用密度計(jì)或折射儀來測定。

2. 不連續(xù)（Discontinuous）密度梯度的制備

2.1 根據(jù)以上公式將SIP溶液稀釋到需要的一系列不同密度；

2.2 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。使用槍頭或者寬口針頭的注射器按照高密度向低密度逐層放置的先后順序，緊貼管壁，任液體自然慢慢流下，確保上層溶液不會濺入下層或者混入分界處。

3. 裝樣

樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過大，細(xì)胞濃度也不可過高，否則會影響細(xì)胞的分離和回收。

4. 離心

一般采用離心力為400 × g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。

5. 取樣

當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時大部分細(xì)胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。

6. 清洗

Percoll由于沒有細(xì)胞毒性，且不會粘附在細(xì)胞膜上，通常來說沒有必要去除。細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)入培養(yǎng)體系，病毒可直接進(jìn)行感染，細(xì)胞器可直接用于代謝功能研究等。也可以根據(jù)以下方法來進(jìn)行清洗去除percoll。

6.1 細(xì)胞樣本的低速清洗（可選）

收獲含有Percoll液的活細(xì)胞層，用生理鹽水或者PBS緩沖液按照5:1的體積比清洗2~3次，每次用200 × g離心2-10 min回收細(xì)胞；

6.2 病毒或者亞細(xì)胞的高速清洗（可選）

病毒或者亞細(xì)胞由于太小難以用低速離心收集獲得，可在吊籃式轉(zhuǎn)頭或角轉(zhuǎn)頭離心機(jī)中高速離心分離這些樣本。收獲含有Percoll液的分離層放入離心管內(nèi)，以吊籃式轉(zhuǎn)頭100,000×g，2 h或者角轉(zhuǎn)頭100,000×g，90 min的條件離心沉淀Percoll顆粒。需要的生物樣本保留在上層溶液。

注意事項(xiàng)

1）Percoll分離推薦使用聚碳酸酯（PC）離心管；Percoll離心后常有二氧化硅顆粒聚集在管底，或者分層時聚集在管壁上。干燥后這些沉淀較難去除，因此建議使用后立即用水沖洗所用設(shè)備。

2）Percoll在pH 5.5-10之間性能不受任何干擾。但低于pH 5.5會發(fā)生膠凝。二價陽離子也會引起膠凝，而溫度升高會加劇此現(xiàn)象發(fā)生。

3）只有不含鹽離子或蔗糖的Percoll（原液）才能高壓滅菌。因?yàn)辂}離子會引起膠凝，而蔗糖會引起焦糖化。高壓滅菌過程盡量減少與空氣接觸，避免在percoll/空氣層間形成固體顆粒，可通過將percoll裝在窄口瓶內(nèi)來避免。如果顆粒已經(jīng)形成，通過過濾或者低速離心的方式去除。滅菌后溶液的損失可加入相應(yīng)體積的蒸餾水補(bǔ)足，密度不會受影響。Percoll不可用濾膜除菌。

4）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。