Calcein AM, Ultra Pure Grade 鈣黃綠素（綠色）
產(chǎn)品描述
Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細(xì)胞膜滲透性的活細(xì)胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團(tuán)的存在不僅加強(qiáng)疏水性，使其能輕易穿透活細(xì)胞膜。而且封閉結(jié)合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。因不具有細(xì)胞膜滲透性，從而被保留在胞內(nèi)。與其它活細(xì)胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AM最適合用于活細(xì)胞染色探針，因細(xì)胞毒性很低，而且不會(huì)抑制任何細(xì)胞功能如增殖或淋巴細(xì)胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分可信，與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法所得結(jié)果一致。
由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這一特征使其非常適合用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域到達(dá)細(xì)胞核，嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對(duì)死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。結(jié)合這些特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用作活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。
本品以粉末形式提供，超純級(jí)別（≥95%），可與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。
產(chǎn)品特性
1） CAS NO：148504-34-1
2）同義名：鈣黃綠素乙酰甲酯；3′-O-乙酰胺-2′,7′-二(羧乙基)-4或5-羧基熒光素，二乙酰甲酯；
3）分子式：C46H46N2O23
4）分子量：994.86
5）純度：≥95%（HPLC）
6）外觀：白色或淺黃色結(jié)晶粉末
7）溶解性：溶于DMSO（1~5mM）
8）化學(xué)結(jié)構(gòu)式：
保存與運(yùn)輸方法
保存：-20℃干燥保存，避免強(qiáng)光直射，有效期一年。
運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)
1）熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2）乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。
3） Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein-AM儲(chǔ)存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用方法
A， 儲(chǔ)存液制備
儲(chǔ)存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據(jù)工作濃度來(lái)決定，建議提前配制成1000×儲(chǔ)存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲(chǔ)存液，即往50μg Calcein, AM（Mw：994.86）內(nèi)加入10μl 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的DMSO即可。
B， 20% Pluronic F-127制備【可選】
稱(chēng)取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。
C， 染色步驟
大多數(shù)實(shí)驗(yàn)體系中Calcein, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定Calcein, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié)果為篩選原則。
1） 取一管適量分裝的儲(chǔ)存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。
【注意】：有時(shí)可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM儲(chǔ)存液內(nèi)來(lái)增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein AM儲(chǔ)存液內(nèi)加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長(zhǎng)期保存，需現(xiàn)配現(xiàn)用。
2） 對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接離心收集細(xì)胞。
3） 去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。
4） 用1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積的Calcein, AM染色工作液重懸細(xì)胞，37℃孵育15～30min。
【注意】：若細(xì)胞自身含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，需加入丙磺舒（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內(nèi)以降低Calcein泄露到胞外。
5） 用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細(xì)胞兩次去除多余染料。
【注意】：如有必要，使用含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩沖液來(lái)進(jìn)行細(xì)胞清洗。用含合適濾光片（Ex/Em= 490nm/515nm）的熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。
