Alexa Fluor 488-Streptavidin Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素
Alexa Fluor 488-Streptavidin（Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素）是鏈霉親和素（Streptavidin）與Alexa Fluor 488熒光染料通過共價鍵偶聯形成的生物探針，結合了鏈霉親和素對生物素的高親和力與Alexa Fluor 488的高亮度熒光特性，是生物素-鏈霉親和素系統的核心熒光標記工具，廣泛應用于免疫熒光、流式細胞術、原位雜交、蛋白質印跡等生命科學研究領域，兼具高特異性、強熒光穩定性和良好的生物相容性。
一、產品基本信息
1. 基礎參數
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參數項
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詳情
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中文名稱
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Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素
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英文名稱
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Alexa Fluor 488-Streptavidin；Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate
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CAS 號
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無單一CAS號（偶聯物混合物），鏈霉親和素CAS：9013-20-1
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分子結構
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鏈霉親和素（四聚體蛋白）與Alexa Fluor 488（磺化熒光素衍生物）通過酰胺鍵共價偶聯
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外觀
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凍干粉或淡黃色至橙黃色澄清溶液（取決于濃度），無可見沉淀
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光學特性
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激發波長495nm，發射波長519nm，量子產率0.92，斯托克斯位移24nm
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溶解性
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易溶于PBS、TBS等緩沖液，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，忌用含巰基還原劑的溶液
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儲存
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-20℃避光密封保存，避免反復凍融；溶解后4℃短期保存（≤1周）
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2. 核心特性與用途
核心特性：鏈霉親和素為非糖基化四聚體蛋白，等電點pI≈5-6，每個亞基可特異性結合1個生物素分子，結合常數Kd≈10?1? M，是非共價相互作用中親和力最強的組合之一，背景極低；Alexa Fluor 488熒光亮度高，抗光漂白性為FITC的10倍，水溶性良好，匹配488nm激光光源，兼容多種熒光檢測設備；偶聯物保留鏈霉親和素的生物素結合活性和Alexa Fluor 488的熒光特性，生物相容性佳、低毒性，不影響細胞活性或生物分子功能，耐受pH 4.0-9.0、高鹽及0-40℃溫度范圍。
主要應用：
- 免疫熒光與顯微鏡成像：標記生物素化一抗或二抗，定位細胞/組織中目標抗原（如膜蛋白、核酸），支持共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡可視化及多色成像（可與AF594、AF647等聯用），適用于腫瘤標志物檢測、細胞器共定位等實驗；
- 流式細胞術：標記生物素化抗體（如CD4、CD8），實現細胞表面標志物的定量檢測與多色分選，熒光通道無串擾，信號穩定；
- 信號放大：在ELISA、免疫組化、原位雜交（FISH）中，通過鏈霉親和素-生物素橋接放大信號，提升低豐度靶標（如腫瘤標志物、病毒抗原）的檢測靈敏度；
- 蛋白質與核酸檢測：用于Western blot、蛋白芯片等實驗，檢測生物素標記的蛋白質、核酸探針，提供高靈敏度熒光信號；
- 活細胞成像：追蹤活細胞內生物素化分子（如蛋白質轉運、內吞途徑），支持長時間動態觀察，不影響細胞正常生理活動。
二、標準使用流程（分場景）
1. 通用實驗原則
- 溶解與稀釋：凍干粉需用無生物素的PBS或TBS緩沖液（可添加0.1% BSA或Tween-20）溶解，配制成母液（1mg/mL），現配現用；工作濃度需根據實驗體系梯度優化，常規范圍0.5-10 μg/mL；
- 孵育控制：孵育溫度可選擇室溫（15-30℃）或4℃，室溫孵育時間10-30分鐘，4℃孵育可延長至1小時，低溫可減少非特異性結合；
- 洗滌要求：孵育后需用含0.05% Tween-20的緩沖液充分洗滌3-4次，每次5分鐘，去除未結合的偶聯物，降低背景信號；
- 避光操作：全程避光（可用錫箔紙包裹容器），避免熒光染料光漂白，影響檢測效果；
- 對照設置：需設置生物素陰性對照（未標記生物素的抗體）和熒光陰性對照（未偶聯AF488的鏈霉親和素），排除非特異性信號干擾。
2. 場景A：細胞免疫熒光染色（固定細胞）
試劑準備：Alexa Fluor 488-Streptavidin凍干粉10 μg，PBS緩沖液（pH 7.4，含0.1% BSA），生物素化一抗，固定液（4%多聚甲醛），通透液（0.1% Triton X-100），洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween-20）。
操作步驟：
1. 細胞爬片培養至適宜密度，用4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘；
2. 加入0.1% Triton X-100通透液，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘；
3. 用含0.1% BSA的PBS封閉30分鐘，去除封閉液，無需洗滌；
4. 加入稀釋好的生物素化一抗，4℃孵育過夜或室溫孵育1小時，洗滌緩沖液洗滌3次，每次5分鐘；
5. 用含0.1% BSA的PBS稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至工作濃度（1-5 μg/mL），滴加至細胞爬片上，室溫避光孵育20分鐘；
6. 洗滌緩沖液洗滌4次，每次5分鐘，最后用PBS洗滌1次；
7. 滴加抗淬滅封片劑，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察（激發波長495nm，發射波長519nm）。
3. 場景B：流式細胞術檢測（細胞表面標志物）
試劑準備：Alexa Fluor 488-Streptavidin母液（1mg/mL），生物素化表面標志物抗體（如CD4），PBS緩沖液（含2% FBS），洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween-20），離心管，流式細胞儀。
操作步驟：
1. 收集培養好的細胞，1000 rpm離心5分鐘，棄上清，用PBS洗滌1次；
2. 用含2% FBS的PBS重懸細胞，調整細胞濃度至1×10? cells/mL，分裝入離心管；
3. 加入適量生物素化抗體，室溫避光孵育30分鐘，洗滌緩沖液洗滌2次，每次1000 rpm離心5分鐘；
4. 用含2% FBS的PBS稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至2-5 μg/mL，加入離心管中，室溫避光孵育20分鐘；
5. 洗滌緩沖液洗滌2次，用適量PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測（激發波長495nm，發射波長519nm），分析數據。
4. 場景C：Western blot檢測（生物素標記蛋白）
試劑準備：Alexa Fluor 488-Streptavidin母液，轉印膜（PVDF或NC膜），封閉液（5%脫脂牛奶/TBST），TBST洗滌緩沖液，熒光成像儀。
操作步驟：
1. 完成蛋白電泳、轉印后，將轉印膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1小時；
2. TBST洗滌緩沖液洗滌膜3次，每次5分鐘；
3. 用TBST稀釋Alexa Fluor 488-Streptavidin至1-3 μg/mL，將膜浸入稀釋液中，室溫避光孵育30分鐘；
4. TBST洗滌膜4次，每次5分鐘，去除未結合的偶聯物；
5. 熒光成像儀下觀察（激發波長495nm，發射波長519nm），記錄實驗結果。
三、關鍵注意事項與常見問題
1. 禁忌與安全
- 操作時佩戴手套、護目鏡和口罩，避免直接接觸皮膚、黏膜和眼睛；不慎接觸后立即用大量清水沖洗15分鐘；
- 全程避光操作，包括溶解、稀釋、孵育和洗滌過程，防止熒光染料光漂白，影響信號強度；
- 儲存時需密封嚴密，置于-20℃避光環境，避免反復凍融（建議將母液分裝成小份，單次使用）；
- 避免使用含生物素的試劑（如某些血清、RPMI 1640培養基）和高濃度巰基還原劑，前者會與鏈霉親和素結合，后者會破壞熒光染料結構；
- 實驗結束后，廢液和廢棄物需按生物試劑廢棄物規范處理，不可隨意丟棄；
- 不同批次產品不可混合使用，避免影響實驗重復性。
2. 常見問題與解決
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問題
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可能原因
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解決方案
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熒光信號弱
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偶聯物濃度過低、孵育時間不足、光漂白、生物素標記效率低
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提高工作濃度至2-5 μg/mL；延長孵育時間；全程避光；優化生物素標記條件
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背景信號高
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洗滌不充分、封閉不足、偶聯物過量、非特異性結合
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增加洗滌次數和時間；延長封閉時間；降低偶聯物濃度；4℃低溫孵育
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熒光淬滅快
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操作未避光、抗淬滅劑使用不當、偶聯物儲存不當
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全程避光；使用熒光抗淬滅封片劑；母液分裝，-20℃密封保存
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無特異性信號
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生物素標記失敗、偶聯物失活、緩沖液含生物素或還原劑
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重新進行生物素標記；更換新鮮偶聯物；使用無生物素、無還原劑的緩沖液
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流式檢測信號串擾
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熒光通道設置不當、與其他熒光染料光譜重疊
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調整流式細胞儀通道參數；選擇光譜分離良好的熒光染料聯用（如AF488+AF647）
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四、配方與試劑搭配（高效組合）
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組合
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適用場景
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優勢
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 生物素化一抗
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免疫熒光、流式細胞術、Western blot
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無需直接標記一抗，簡化實驗流程，信號特異性高、亮度強
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 生物素化核酸探針
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原位雜交（FISH）、核酸檢測
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信號放大效果顯著，提升低豐度核酸靶標的檢測靈敏度
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 抗淬滅封片劑
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免疫熒光成像（固定細胞/組織切片）
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延緩熒光淬滅，延長觀察時間，保證成像質量
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + 含BSA緩沖液
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所有實驗場景
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減少非特異性結合，穩定偶聯物活性，降低背景信號
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Alexa Fluor 488-Streptavidin + AF594/AF647標記偶聯物
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多色熒光成像、多指標流式檢測
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光譜分離良好，無信號串擾，可同時檢測多個靶標
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